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系列专题报道|碱基编辑系统的风险与优化
2020-04-23

编辑 | 河阳山岳

       碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术。CRISPR/Cas9自从2012年被发明以来,以其高效性和特异性备受各界关注,然而由于CRISPR/Cas9系统存在的脱靶风险,因此未来应用于临床治疗方面还存在一些不确定的因素。在2016年和2017年,华人科学家David R. Liu(刘如谦)课题组先后报道了高效诱导点突变的胞嘧啶单碱基编辑器(CBE,2016年4月)和腺嘌呤单碱基编辑器(Adenine base editor,ABE,突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC【1】,由于单碱基基因编辑器不引入DNA断裂,过去一段时间被认为比传统方法更加高效而安全,能为单基因遗传病的治疗带来了新的希望(目前已知的人类致病遗传变异中,约58%都属于点突变,而接近半数的致病点突变都属于G·C--A·T变异,约15%的致病点突变都属于T·A--C·G变异),2017年成功入围《科学》杂志最终评选的十大科学突破。
      目前依据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)。这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑,最终可以分别实现C-T (G-A)或A-G (T-C)的碱基替换。碱基编辑技术自2016年被开发以来,因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势,已经成功应用在各种动物、植物及其他生物中,为基因治疗及精准作物育种等领域提供了重要技术支撑。
       BioArt汇总了最近有关碱基编辑系统的研究进展,以飨读者。点击图片即可查看微信推送原文。

1. 特别推荐丨碱基编辑系统研究进展【2】

       2019年8月21日,中科院遗传发育所高彩霞研究团队在线发表了题为“碱基编辑系统研究进展”的综述。该文章从碱基编辑技术的特点、开发过程、优化、应用、脱靶效应及改善策略等方面进行了系统介绍,最后对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化碱基编辑系统提供参考。

 

2. 专家热评Science丨杨辉组/高彩霞组“背靠背”首次发现单碱基编辑系统存在严重脱靶效应【3, 4】

       2019年3月1日,Science 杂志“背靠背”在线发表了两篇来自中国科学家完成的研究论文,分别用不同的方法在不同的物种上首次发现了单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应,这给当前如火如荼开展的相关临床试验蒙上了一层阴影。
       题为Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos的研究论文由中科院神经科学研究所杨辉研究组与中科院上海营养与健康研究所李亦学研究组、斯坦福大学遗传学系Lars M. Steinmetz研究组以及中国农业科学院深圳农业基因组研究所的研究人员合作完成。该研究探索了全基因组范围内基因编辑技术可能造成的脱靶效应,建立了一种被命名为GOTI(Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection)的新型脱靶检测技术,并使用该技术发现: 近年来兴起的单碱基编辑技术有可能导致大量无法预测的脱靶。总的来说,该研究证实了以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险,让世人重新审视了这些新兴技术的风险。

       题为Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice 的研究论文由中科院遗传与发育研究所高彩霞研究组完成。该研究在水稻中对不同单碱基编辑系统的特异性进行了全基因组水平评估,首次在体内利用全基因组测序技术全面分析和比较了这三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应。该研究表明现有BE3和HF1-BE3系统可在植物体内造成难以预测的脱靶突变,因此,需要进一步优化提高碱基编辑系统的特异性。

3. NBT | David Liu又一力作:拓宽碱基编辑适用范围【5】

       2019年5月21日,刘如谦教授团队在Nature Biotechnology 上在线发表了题为Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors 的文章,报道了环状排列以及PAM位点修饰的Cas9拓宽了碱基编辑的范围,为碱基编辑技术的更广泛应用提供了有力工具。该项研究结合了最新的研究进展对基于Cas9的碱基编辑技术进行了进一步的改进,获得了良好的编辑效率,并且使得原来无法得到编辑的碱基(距离典型PAM位点有一定距离)得到了编辑,因而扩展了碱基编辑的范围,有着广泛的应用前景。

4. Genome Biology丨杨辉、陈子江等联合发布人分裂期胚胎介导高效的单碱基编辑系统【6】

       单碱基编辑技术提供了一种强大而安全的方法来诱导特定的点突变, 可用于纠正由单碱基突变引起的单基因遗传病。但人类胚胎的单碱基编辑效率普遍较低 (低于30%), 经常导致嵌合体, 限制了目前单碱基编辑在人类胚胎中的应用。
       2019年5月23日,中国科学院神经科学研究所杨辉研究组与上海交通大学仁济医院陈子江教授、俄勒冈健康科学大学Shoukhrat Mitalipov教授研究组合作在Genome Biology 发表了一篇名为“Human cleaving embryos enable robust homozygotic nucleotide substitutions by base editors ”的研究论文,该研究发现BE3和ABE7.10在2细胞和4细胞时期注射编辑效率远高于中期 ii (mii) 卵母细胞或受精卵注射,并基于此建立了一种在人早期胚胎中实现高效单碱基编辑的技术, 为研究人类胚胎发育中的基因功能提供了一种强有力的方法。

5. 专家点评Nature | 杨辉/郭帆/李亦学等开发更高精度的单碱基基因编辑工具,全面降低RNA脱靶风险【7】

       杨辉团队及其合作者郭帆团队、李亦学团队研究发现,DNA单碱基编辑工具CBE和ABE均存在大量的RNA脱靶效应,更为重要的是,研究人员对多种热门的存在脱靶风险的单碱基基因编辑工作进行了改造,最终获得了更高精度的单碱基基因编辑工具,为推动单碱基基因编辑技术进入临床治疗提供了重要的基础。相关工作“Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis ”于2019年6月11日在线发表在Nature 杂志上。

       研究者通过一系列分析证明这RNA脱靶主要是由于DNA单碱基编辑器的脱氨酶APOBEC1 (BE3)和TadA (ABE)所导致的,团队还发现很高比例的RNA脱靶发生在癌基因和抑癌基因上,如果用于临床治疗有较大的致癌风险。国内外研究团队揭示的系列脱靶风险,加强了世人对单碱基编辑工具的安全性的审视。
       为了获得更加精准的单碱基编辑工具,研究团队通过引入突变的方法对两种DNA单碱基编辑器的胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶分别进行了优化,最终获得了能够完全消除(BE3)/降低(ABE)RNA脱靶并维持DNA编辑活性的高精度单碱基编辑工具。此外,杨辉团队开发的ABE突变体还能够缩小编辑窗口,实现更加精准的DNA编辑。

6. Nat Biotech丨效率更高、兼容性更好,David Liu研发噬菌体辅助持续演化的单碱基基因编辑器【8】

       与利用程序化核酸酶产生双链DNA断裂(DSB)从而引起同源重组修复的基因编辑方式相比,单碱基编辑技术的效率更高,但是其局限性也不容忽视,以CBE为例,其缺点主要体现在以下几个方面:1.脱靶效应;2.适用范围有限,要求NGG PAM序列与目标C有一个特定距离;3.识别位点特异性有限,编辑窗口内的C都有可能被编辑。因此,改造CBE以发挥其最大优势成为目前的研究趋势。
       研究发现,通过改变CBE的融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶可以有效增加编辑效率。基于CBE的复杂程度以及现阶段单碱基编辑器开发的需求——适用于特定应用的编辑器的开发,2019年7月22日,来自美国哈佛大学的David Liu课题组在Nature Biotechnology 上在线发表题为Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity 的文章,开发了一个噬菌体辅助持续演化的单碱基编辑系统(BE-PACE),可以根据应用需求,在快速进化CBE的同时,大大提高CBE的编辑效率和靶序列兼容性。
       总之,本研究应用PACE平台,开发了一个新的单碱基基因编辑优化系统,使得单碱基基因编辑的效率更高、兼容性更好,而本文开发的优化CBE的方法——BE-PACE平台可将继续用于丰富单碱基基因编辑的性能,扩大碱基编辑的应用范围,加深人们对碱基编辑结果决定因素的影响的认识,为单碱基基因编辑系统的优化提供强大工具。

7. NBT | ABE单碱基编辑器的新风险——介导胞嘧啶的脱氨基化【9】

       前面多项研究指出,ABE系统存在大量的RNA脱靶,好在研究者通过点突变策略成功的降低了ABE系统在RNA水平的脱靶,改善了ABE系统的安全性。此外,有研究者在应用ABE系统时注意到,部分位点上的胞嘧啶(C)有一定的概率会被编辑为其它碱基。2019年9月23日,来自韩国汉阳大学化学系的Sangsu Bae实验室与首尔国立大学的Jin-Soo Kim实验室合作在Nature Biotechnology 杂志上发表了题为Adenine base editors catalyze cytosine conversions in human cells 的论文。文章对ABE系统介导胞嘧啶(C)编辑的能力进行了系统分析,文章证实ABE系统编辑胞嘧啶(C)的能力并非偶然,它能编辑位于sgRNA位点5-7位(PAM为21-23位)的TC*N序列中的胞嘧啶(C),该能力独立于其介导A·T--G·C碱基对转换的能力,且最高效率可达11.2%。
       总体而言,本研究首次系统性的分析并证实了ABE系统介导胞嘧啶(C)脱氨基化的能力,这一结果再次提醒研究者,单碱基编辑系统的安全性依然有提升的空间;不过研究结果也提示,ABE系统具备用作胞嘧啶(C)编辑工具的潜力,其独特的编辑特性或可拓宽现有CBE工具的适用范围。

8. Nat Biotech | CBE单碱基编辑器的Cas9非依赖型DNA脱靶风险评估及优化【10】

       2019年,杨辉组/高彩霞组通过全基因组测序分析指出,除了传统的Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶风险之外,CBE系统还存在Cas9非依赖型的DNA脱靶风险,极大限制了CBE系统的应用。目前,CBE系统的Cas9非依赖型脱靶风险评估主要依赖于全基因组测序分析,该方法虽然全面,但耗时费力,花费不菲,难以用于规模化的评估和筛选,因而极大的限制了相关研究的开展,对CBE系统的优化和未来应用极为不利。
       2020年2月10日,来自Broad研究所、哈佛大学化学系和化学生物系的David Liu实验室在Nature Biotechnology 杂志上发表了题为Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors 的论文。文章基于细菌中的利福平耐药和胸苷激酶基因突变实验以及人源细胞系中的R-loop实验、体外动力学实验和细胞内ssDNA脱氨基实验等开发出较全基因组测序更为快速、便捷且经济的实验策略,并以此为基础对多种CBE系统的Cas9非依赖型DNA脱靶风险进行了有效评估;之后研究者还通过蛋白质工程等策略对CBE系统进行优化,有效减少了Cas9非依赖型DNA脱靶风险的发生。
       值得一提的是,2月9日,中科院神经科学研究所杨辉团队在预印版平台bioRxiv 发表文章High-fidelity base editor with no detectable genome-wide off-target effects 。两篇文章用不同筛选策略,得到相似结果,很好的印证了彼此的发现。

       此外,2018年期间,碱基编辑工具的开发还有两项值得一提的工作成果:

9. Nat Biotech丨上科大、中科院联合开发新型碱基编辑器【11】

       2018年3月20日,上海科技大学生命学院陈佳教授研究组、中国科学院-马普计算生物学研究所研究员杨力研究组与上海科技大学生命学院黄行许教授研究组通过合作研究,开发出一系列基于CRISPR/Cpf1(Cas12a)的新型碱基编辑器(Cpf1-BE),相关成果以Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion 为题,在Nature Biotechnology 上在线发表。
目前已报道的碱基编辑系统均依赖于靶点旁侧的PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列。SpCas9和SaCas9蛋白所识别的PAM序列多含鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C-rich),因此,已报导的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集(A/T-rich)区域进行高效的碱基编辑操作。由此,研究人员构建了基于Cpf1的新型碱基编辑器来实现在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域的碱基编辑操作。这种基于Cpf1的新型碱基编辑器与现有的基于Cas9的碱基编辑器可实现碱基编辑的有效互补,为碱基编辑系统在基础研究及未来临床领域的全面深入应用提供了新方法、拓展了新思路。

10. Nature Biotechnology丨陈佳/黄行许/杨力合作组开发出普适型碱基编辑器【12】

       某些人类疾病中可能出现的碱基T到C的突变而且处于易被DNA甲基化修饰的CpG二核苷酸位点,而目前基于APOBEC1/AID脱氨酶的单碱基基因编辑方法在遇到甲基化修饰的CpG二核苷酸位点时其效率会大幅降低。
       陈佳/黄行许/杨力研究团队开展合作研究,成功开发出一系列基于人胞嘧啶脱氨酶APOBEC的新型普适碱基编辑器,其中基于人APOBEC3A(hA3A)的碱基编辑器可高效介导甲基化胞嘧啶mC到胸腺嘧啶T的编辑,相关工作于2018年8月20日以 Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion 为题在Nature Biotechnology 上在线发表。与之前报道的基于大鼠APOBEC1的碱基编辑器相比,基于人APOBEC3A 的新型碱基编辑器hA3A-BE应用范围更加广泛和全面,同时,通过对人APOBEC3A的系统性改造,研究团队成功缩小了hA3A-BE的编辑区间,进一步提高了其碱基编辑的精度。这为碱基编辑系统在基础研究及未来临床领域的全面深入应用提供了新工具、新方法和新思路。

       总之,碱基编辑技术的开发为定向修正碱基突变和创制基因组中的关键核苷酸变异提供了重要工具,展现了其在遗传疾病治疗与动植物新品种培育等方面的重大应用价值,该技术的进一步优化及改造将推动农业生产,生物医药及生命科学等领域的快速发展。碱基编辑技术的迅猛发展,将使得单碱基编辑系统变得越来越精确,有朝一日,单碱基编辑系统可能极大地推动疾病模型制备、动植物的育种和人类疾病的临床治疗。
  

参考文献:
1, Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017).

2, 宗媛,高彩霞. 碱基编辑系统研究进展. 遗传 41, 777-800, doi:10.16288/j.yczz.19-205 (2019).
3, Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295, doi:10.1126/science.aaw7166 (2019).
4, Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292, doi:10.1126/science.aav9973 (2019).
5, Huang, T. P. et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors. Nature Biotechnology 37, 626-+, doi:10.1038/s41587-019-0134-y (2019).
6, Zhang, M. et al. Human cleaving embryos enable robust homozygotic nucleotide substitutions by base editors. Genome Biology 20, doi:10.1186/s13059-019-1703-6 (2019).
7, Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-+, doi:10.1038/s41586-019-1314-0 (2019).
8, Thuronyi, B. W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nature Biotechnology 37, 1070-+, doi:10.1038/s41587-019-0193-0 (2019).
9, Kim, H. S., Jeong, Y. K., Hur, J. K., Kim, J.-S. & Bae, S. Adenine base editors catalyze cytosine conversions in human cells. Nature Biotechnology 37, 1145-+, doi:10.1038/s41587-019-0254-4 (2019).
10, Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A. & Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology, doi:10.1038/s41587-020-0414-6 (2020).
11, Li, X. et al. Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nature Biotechnology 36, 324-+, doi:10.1038/nbt.4102 (2018).
12, Wang, X. et al. Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion. Nature Biotechnology 36, 946-+, doi:10.1038/nbt.4198 (2018).

 

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