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许叶春/叶阳/吴妍/白芳等发现黄芩苷和黄芩素可在体外抑制新冠病毒3CL蛋白酶的活性及病毒复制
2020-04-22

撰文丨亨利
责编丨迦溆


中药经过几千年的发展,成为了药物发现的宝贵资源。例如,青蒿素及其衍生物蒿甲醚的发现对于疟疾治疗是一个里程碑的贡献。中药在此次抗击疫情中发挥了重要的作用,同时也为新型抗病毒药物的研发提供了丰富的资源和重要的思路。

2020年4月14日,中科院上海药物所许叶春叶阳与中科院武汉病毒所吴妍及上海科技大学白芳等合作在预印本网站bioRxiv上发布了题为“Discovery of baicalin and baicalein as novel, natural product inhibitors of SARS-CoV-2 3CL protease in vitro”的研究成果,报道了黄芩主要成分黄芩苷和黄芩素为新冠病毒(SARS-CoV-2)3CL蛋白酶的新型抑制剂,并且在细胞水平能有效抑制SARS-CoV-2的复制。




中草药及天然产物已有多种抗病毒活性的报道和记载,其中黄芩及其成分曾用于防治肝炎和呼吸系统疾病等。3CL蛋白酶是水解冠状病毒多聚蛋白前体产生功能性非结构蛋白的主蛋白酶,在病毒复制中发挥关键作用,而其底物选择性具有高度保守性,因而是理想的广谱抗病毒药物靶点之一。研究者们首先利用荧光共振能量转移方法(FRET)测定了黄芩总水提物和组分对新冠病毒3CL蛋白酶的抑制活性,发现其中两个组分在10.0 μg/mL时具有显著的抑制作用,而这两个组分中主要包含的化合物分别为黄芩苷和黄芩素。进一步测定黄芩苷和黄芩素单体对SARS-CoV-2 3CL蛋白酶抑制的IC50分别为6.41 μM和0.94 μM。同时等温滴定量热法(ITC)和高分辨率质谱(MRMS)确证了黄芩苷和黄芩素以非共价方式特异性地与蛋白酶结合,并获得了这两个天然产物与3CL蛋白酶的结合常数。



紧接着,研究者们利用了X射线晶体学方法解析了分辨率为2.2 Å的黄芩素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶复合物的晶体结构,揭示了黄芩素独特的作用模式。复合物结构中黄芩素的三个酚羟基与Leu141/Gly143主链和Ser144/His163侧链形成了多个氢键,与Gln189/Arg188/Met49/Cys44/His41等残基形成了疏水相互作用,与催化氨基酸Cys145形成了S-p相互作用。因此,黄芩素作用于3CL蛋白酶底物结合口袋中的核心位置,并与两个催化残基、氧离子空穴(残基138–145)、Glu166和S1/S2位点等相互作用,而这些都是识别底物及类肽抑制剂的关键残基和位点。



新冠病毒3CL蛋白酶的氨基酸序列与SARS-CoV 3CL蛋白酶序列的等同性为96%,因此推测黄芩素也能很好地抑制SARS-CoV的3CL蛋白酶,黄芩素抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶的IC50为1.18 μM。比较分析抑制剂结合的所有SARS-CoV及SARS-CoV-2 3CL蛋白酶晶体结构发现,黄芩素与3CL蛋白酶的结合方式完全不同于已知抑制剂。如果已知类肽抑制剂被描绘成与底物竞争结合的“剑”,黄芩素则象坐落于两个催化氨基酸前充当“盾牌”,从而防止底物接近活性位点。黄芩素独特的结合方式,加上分子量小但配体结合效率高,使其具有很好的研发价值。

为了进一步评价黄芩苷和黄芩素对新冠病毒的抗病毒作用,研究者们首先用CCK8法测定两个化合物对细胞的毒性,发现这两个化合物的细胞半数毒性浓度(CC50)超过200 μM,表明黄芩苷和黄芩素的细胞毒性非常低。随后,通过qRT-PCR检测细胞上清液中病毒拷贝数以评价化合物的抗病毒效果,发现黄芩苷和黄芩素对SARS-CoV-2的复制均呈剂量依赖性抑制,两个化合物的半数有效浓度(EC50)分别为10.27 uM和1.69 uM。因此,综合细胞毒性和病毒复制抑制活性,黄芩素的细胞抗病毒效应优于大多数报道的化合物。黄芩苷片在中国已被用作急性、慢性或持续性肝炎的辅助治疗,而黄芩素已完成临床一期实验,目前正在开展抗流感相关症状的临床二期实验;一些用于治疗新冠病毒感染患者的中药或中成药(如清肺排毒汤和双黄连口服液)也含有黄芩。这些临床安全性数据结合本项研究中发现的对新冠病毒3CL蛋白酶活性及细胞中病毒复制的有效抑制结果,表明黄芩苷和黄芩素对新冠肺炎的治疗具有潜在应用价值。

总的来说,这项研究为探索中药或中成药的体外药效和有效识别针对特定靶点的生物活性成分研究提供了一个范例。

值得注意的是,4月12日,北京大学来鲁华团队在bioRxiv也发布了黄芩通过抑制3CL蛋白酶抑制新冠病毒复制的实验结果。这些研究结果表明黄芩及其主要成分具有进一步研发成为抗冠状病毒药物的前景。




原文链接:
https://doi.org/10.1101/2020.04.13.038687




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