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张锋实验室公布CRISPR程序检测COVID-19的详细方案
2020-02-17
编译 | 栾晓东
责编 | 雪月
 
(随着继续优化此方案,将上传更新的版本,有兴趣使用患者样品测试该方案的科研团队可以通过发送电子邮件,请求指导 sherlock@broadinstitute.org,并且可应要求提供有限数量的Cas13酶、crRNA和侧向报道基因的起始样品)
(重要说明:此协议不得用于临床目的,因为他们无法获取患者样本,因此无法使用真实的患者样本来验证该测定。)
一、概述
临床医生和科学家们目前虽然可以使用qPCR,来诊断新型冠状病毒COVID-19,但由于试剂和设备的不足,可能一定程度上减慢疾病检测的速度。为了帮助推进COVID-19的诊断,在此描述一种基于CRISPR的SHERLOCK(高灵敏度酶促解锁)技术,检测COVID-19的方案。使用合成的COVID-19病毒RNA片段,能够在20到200 aM(每微升输入10-100拷贝数)之间一致地检测COVID-19靶序列。从用于qRT-PCR测试的核酸提取开始,本检测方案分为三个步骤,并且可以在1小时内完成。
步骤(1)孵育25分钟(使用重组酶聚合酶扩增(RPA)试剂盒等温扩增提取的核酸样品);
步骤(2)孵育30分钟(使用Cas13检测预先扩增的病毒RNA序列);
步骤(3)孵育2分钟(使用的试纸/层析纸读取检验结果)。
 
以下各节详细介绍了所需的试剂和步骤。
二、标本和核酸提取:
应根据适当的生物安全程序收集患者样本,参考2020 CDC COVID-19方案,有关样本收集和后续核酸提取的详细信息。从步骤(1)开始,此方案的输入可以是与qRT-PCR分析中使用相同的核酸。
A材料和试剂

试剂:重组酶聚合酶扩增(RPA)试剂盒(TwistAmp®Basic;TABAS03KIT);ProtoScript®II逆转录酶(M0368L);裂解缓冲液(在ddH2O中为400mM Tris pH 7.4);RNA酶抑制剂;T7 RNA聚合酶;核糖核苷酸溶液套装;氯化镁溶液;用于稀释Cas13蛋白原液的存储缓冲液(结合2.5 mL 1M Tris pH 7.4、6mL 5M NaCl,2.5 ml甘油和100μL1M DTT和38.9 ml ddH2O);LwaCas13a蛋白;HybriDetect试纸条(MGHD 1)。

设备:37℃水浴锅、42℃水浴锅、微量离心机,适配1.5mL EP管。

引物:
靶向S基因的RPA扩增引物对

S-RPA-Forward_v1:

5’-GAAATATACTACGACGACTGATCACATACTACTTCTGTT TACATAGA-3’;

S-RPA-Reverse_v1:

5'-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3';

针对Orf1ab引物对

Orf1ab-RPA-Forward_v1:

5’-GAATAATATACGACTACGGAGGAGTGTGAGATAGACATAT

ActAAAC-3’;

Orf1ab-RPA-Reverse_v1:

5'-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3';

用于检测S基因的LwaCas13acrRNA

S-crRNA_v1:

5’-GuuuAgAccCCAAACAGGAGGACUCAAACAGCGACCAC

AGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3;

用于检测Orf1ab基因的LwaCas13acrRNA

Orf1ab-crRNA_v1:

5’-GuuuaGaCuCCAAACAGGAGGGACUACAUACACUCUCU

UCUGUAAUUUUUAAACUAU-3';

读出横向血的报告基因RNA:

Lateral-Flow-Reporter:

5'-/56-FAM / mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3';

阳性对照序列(可以使用T7转录从合成的DNA寡核苷酸产生):

新冠病毒S基因片段:

5'UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUCUCUUUAAUAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUGACUGUACAGAUGCUGAGAU

新冠病毒Orf1ab基因片段:

5'GAAAUUAAUACGACUCACUAUAGGGACUCUUGAAACUGCUCAAAAUUCUGUGCGUGUUUACAGAAGGCCGCUAUAACAAUACUAGAUGGAAUUUCACAGUAUUCACUGAGACUCAUUGAAUUGCUAUGACUUCAUGAUGAUUCACAUCUGAUUUGGCUACUAACAUAUAUACUAUGACUUGAUCUGAUCUGAUCCUAU

B实验步骤:

提示:为防止样品污染,需使用两个不同的工作区域来执行步骤(1)和(2)。步骤(1)应该在前置放大区域中进行,其对污染非常敏感。请勿在步骤(1)的工作区域中打开扩增的样品,步骤(2)、步骤(3)需要一个单独的区域(扩增后区域)执行。所有反应应在指定温度下孵育之前在冰上进行。

 

步骤(1)等温扩增:

1、为了测试每个样品,设置两个RPA反应,分别检测S基因靶标和Orf1ab靶标。此外,可以使用合成病毒片段建立S基因和Orf1ab的阳性对照。还应建立不添加测试样品的阴性对照。使用RPA试剂盒中提供的29.5ul的Rehydration Buffer重悬每个冻干的RPA沉淀。

2、对于S基因,可以如下设置每个反应:

溶液名称

体积(微升)

Resuspended RPA solution

5.9

S- RPA-PROTEDVIV1(10μM)

0.5

S- RPA-ReVIESEV1(10μM)

0.5

PrimScript RT(100000 0U/ml)

0.2

ddH2O

0.4

待测样本

1

MgAc(RPA Kit中提供)

2.5

总体积

11

3、对Orf1ab基因,可以如下设置每个反应:

溶液名称

体积(微升)

Resuspended RPA  solution

5.9

ORF1AB-RPA-PROTEDVIV1(10μM)

0.5

ORF1AB-RPA-ReVIESEV1(10μM)

0.5

PrimScript RT(100000 0U/ml)

0.2

ddH2O

0.4

待测样本

1

MgAc(RPA Kit中提供)

2.5

总体积

11

4、充分混合后,在预热的水浴中于42°C孵育25分钟。孵育结束后,立即将EP管放回冰上,直到准备加入步骤(2)中的反应中。

 

步骤(2)使用Cas13检测病毒RNA序列

1、取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2 mg/mL,4 ul),使用122.5 uL的存储缓冲液重悬。

2、对于每个S基因RPA反应,按以下步骤建立Cas13检测反应:

溶液名称

体积(微升)

裂解缓冲液(400mM Tris pH  7.4)

2

ddH2O

9.6

LwaCas13a蛋白(重悬)

2

S- CRRNAYV1(10 ng/UL)

1

横向流量报告仪(20 uM)

1

RNase抑制剂

1

T7聚合酶

0.6

核糖核苷酸溶液

0.8

氯化镁(120mM)

1

步骤(1)的RPA反应溶液

1

总体积

20

 

3、对于每个Orf1ab基因RPA反应,如下设置Cas13检测反应:

溶液名称

体积

1.裂解缓冲液(400mM Tris pH 7.4)

2微升

2. 二次蒸馏水

9.6微升

3. LwaCas13a蛋白(重悬)

2微升

4. ORF 1AB-CRRNAYV1(10 ng/UL)

1微升

5.横向流量报告仪(20 uM)

1微升

6. SUPERase•In RNase抑制剂

1微升

7. Lucigen T7聚合酶

0.6微升

8.核糖核苷酸溶液

0.8微升

9.氯化镁(120mM)

1微升

10.步骤(1)的RPA反应

1微升

20微升

4、设置完所有反应后,涡旋充分混合,并使用台式离心机离心,接下来在预热的37°C水浴锅中于孵育30分钟。孵育后,将反应管放回冰上,继续进行步骤(3)。

步骤(3)–通过试纸条直观地读取检测结果

1、步骤(2)之后,向每个20ul反应物中添加80ul HybriDetect分析缓冲液并充分混合,将稀释的反应液置于室温下的管架中。

2、将HybriDetect试纸条放入每个反应管中,然后等待反应流过试纸条。

3、阳性对照样品应显示两条线,而阴性对照样品应仅显示底线。

4、对于每个测试样品,检查S和Orf1ab基因是否都出现两行,表明新冠病毒结果呈阳性。

 
三、实验结果:
使用合成新冠病毒S基因和Orf1ab基因RNA片段的梯度稀释液,能够检测到每微升10-100拷贝的合成新冠病毒RNA序列的。以下是针对不同输入浓度的示例图像:
 
 
四、附加信息:
可以在以下参考中找到用于设置基于SHERLOCK检测的详细通用方案:
SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, and Zhang F. Nature Protocols. 2019 Oct;14(10):2986-3012. doi: 10.1038/s41596-019-0210-2.
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