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【黄军就点评】科学狂人Nature发表编辑人类胚胎成果丨BioArt特别关注
2019-09-22

BioArt按科学狂人Shoukhrat Mitalipov曾被美国科学院、艺术科学院、医学科学院三院院士Douglas C. Wallace(国际线粒体医学领域的顶尖学者)誉为“绝无仅有的天才”(exceptionally talented person),他是一位在生物伦理学界饱受争议的科学家。Mitalipov博士此前因为置换了一对孪生雄猴的线粒体而名噪一时,此后在此基础上进一步获得了置换线粒体的人类卵细胞而进一步走进公众视野,2013年更是因为通过核移植技术首次获得了人类胚胎干细胞而引发学术界和大众的热议,如今Mitalipov又成为了美国第一位利用基因编辑技术编辑人类胚胎进行致病基因修正的科学家,再次进入各大新闻媒体的头条。8月2日,Nature杂志以长文形式(Article)发表了俄勒冈国家灵长类动物研究中心Shoukhrat Mitalipov研究组联合韩国基础科学研究所国立首尔大学Jin-Soo Kim研究组、加州Salk生物医学研究所Juan carlos izpisua Belmonte研究组以及中国华大基因的研究人员等合作完成的题为“Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos”的重要研究论文,利用CRISPR-Cas9 基因组编辑技术修正了未被植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏疾病有关的变异,并进一步证实编辑人类生殖细胞系(卵子、精子或早期胚胎)的DNA是安全有效的。然而,该技术在进入临床应用前仍然面临着诸多亟待解决的问题,后续需要更多的相关研究进一步评估该技术的可靠性、安全性以及面临的伦理问题。事实上早在2015年来自中山大学的黄军就副教授就利用基因编辑技术改造了人类胚胎,黄军就博士还因此成为了Nature2015年度十大科学人物。值得一提的是,Nature对这项研究成果还配发了评论文章“At the heart of gene edits in human embryos”,对上述研究给予了很高的评价并且对该技术应用于临床提出了一些亟待解决的问题。鉴于该成果可能会产生一系列重要社会反应,BioArt特别邀请了中山大学黄军就教授对该项成果进行了详细的点评,以飨读者!


论文解读

 

撰文丨丁广进

评论丨黄军就(中山大学生命科学学院)

 

7月26日,《MIT技术评论》的一篇题为“First Human Embryos Edited in U.S.”的报道顿时引爆了生物圈,该报道瞬间引发国内外各大媒体的广泛转载,一时间编辑人类胚胎修正致病基因成为热门话题。

 

由于当时的新闻报并没有具体的相关论文信息,一时间也无法获知具体的实验结果,甚至还有人对这项工作是否能发表出来表示怀疑。然而,相关论文在一周后就在Nature上发表出来了,实验结果也是让人十分兴奋的。这篇论文是由多家研究单位合作完成的,来自中国的华大基因也有三位科学家(华大基因研究院院长徐迅,Jianhui Gong,顾颖)参与了该项工作,值得关注的是该文有五位共同通讯作者,而此前一般认为Nature杂志限定通讯作者最多不超过3人。

 

利用基因编辑技术对人类胚胎进行编辑早就不是什么新闻了,事实上早在2015年来自中山大学的黄军就团队就曾在Protein & Cell杂志上发表文章率先利用CRISPR–Cas9基因编辑技术对人三原核(3PN)受精卵中的地中海贫血症相关基因HBB(β-globin gene,编码红细胞β-珠蛋白)进行了改造下图目前该文在谷歌学术上被引次数超过400次【4】。

 

 

去年 4月,来自广州医科大学附属第三医院的范勇团队Journal of Assisted Reproduction and Genetics 杂志上发表文章,报道了他们使用CRISPR/Cas9技术对人三原核(3PN)受精卵中的细胞膜蛋白基因CCR5基因(HIV病毒入侵T细胞的主要受体之一)进行编辑获得了能有效免疫艾滋病病毒的 CCR5Δ32 缺陷基因【5】。

 

今年3月,来自广州医科大学附属第三医院刘见桥团队与北京蛋白质组研究中心的唐立春博士等合作在Molecular Genetics and Genomics杂志上发表文章,首次将CRISPR/Cas9技术运用于人类二倍体胚胎,对突变的HBBD6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,该基因纯合突变会导致蚕豆症)基因进行了修复【6】。

 

由于上述三项来自中国的成果都存在一定的镶嵌胚胎和基因编辑脱靶效应,所以上述成果也引发了一些争议和对将来可能应用于临床中安全性的质疑。

 

在这项研究中,研究人员首次运用CRISPR–Cas9基因编辑技术在人类早期胚胎中修正了一种与心肌肥大发生相关的突变基因MYBPC3,并且评估了该项技术的有效性和安全性。这项技术未来如果运用于临床治疗,那么许多遗传病患者将有可能通过该技术阻止将有害变异的基因传递给后代。

 

肥厚型心肌病HCM, Hypertrophic cardiomyopathy)是一种表现为心室肌肥厚的心肌病,主要特别是室间隔的非对称性肥厚(下图)。肥厚型心肌病有很高的猝死风险,是运动性猝死的原因之一【7】。该疾病是一种常染色体显性遗传病,有一半以上的疾病呈现家族聚集性,目前该病的全球发病率约为1/500【8】。

 

正常和心肌肥厚型心脏。图片来源:Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of Medicine 1 (2)

 

在众多导致肥厚型心肌病(HCM)发生的突变基因中,MYBPC3(心肌肌球蛋白结合蛋白 C3)是最为常见的致病基因【9】,其突变所致HCM 占到 20%~25%【10】,在家族性HCM中占到大约40%。目前针对HCM的治疗方案可以缓解症状但是不能从根本上解决遗传突变的因素。

 

随着近年来以CRISPR–Cas9为代表的基因编辑技术的广泛应用,通过基因编辑手段修正人类胚胎中的突变致病基因慢慢地变得容易可行。

 

在这项研究中,研究人员使用妇女自愿捐献的卵和患有肥厚型心肌病的患者(携带单拷贝MYBPC3突变基因)提供的精子进行研究。CRISPR–Cas9技术主要由韩国基础科学研究所的Jin-Soo Kim课题组提供。此前的研究往往都是在实施体外受精之后的受精卵中注射CRISPR–Cas9系统,但是这种技术面临的最大问题是会产生一些嵌合体胚胎,得到的是混合有基因编辑修复过和没有修复过的胚胎,这也会带来一些列衍生的问题。而这项研究中,研究人员在向卵细胞中注射精子的同时也将CRISPR–Cas9一并注射进入,最终的结果是这个方法具有很高的准确性,嵌合体胚胎并没有产生(下图)。

 

 

图片引自Nature配发的评论文章“At the heart of gene edits in human embryos”

 

实验结果表明,在实验组中的58个受试胚胎中,有42个胚胎没有携带肥厚型心肌病致病基因突变,占比74.2%对照组为47.4%,因为理论上如果不进行基因编辑处理,也有一半的精子是正常的,所以对照组的比理论上为50%),换句话说就是将产生完全正常的胚胎的比例从50%提高到了74.2%。其中,非常有意思的一个发现是,在这42个正常胚胎中,仅有一个胚胎最终获得野生型的致病基因是利用基因编辑技术以引入的模板进行修正的,也就是说野生型MYBPC3基因的母源拷贝才是大多数胚胎中进行基因修正的模板。而余下的27.6%的胚胎引入了一些非预期的插入或缺失突。

 

图左为基因编辑前的受精卵,右图是受精卵进行基因编辑后正常发育至8细胞期

 

在未来的临床应用当中,基因编辑过程中的脱靶问题一直以来都是人们最关心的问题之一,因为这直接关联了该技术的安全性。在这项研究中,研究人员为了降低基因编辑脱靶带来的风险,他们采用注射重组好的Cas9蛋白而不是质粒来完成基因编辑,这种方法减少了酶暴露的时间,增强了基因编辑的特异性。为了进一步验证是有出现基因脱靶位点,研究人员通过深度测序手段对基因组进行了分析,结果并没有检测到脱靶位点。

 

此外,该论文的作者还在论文讨论部分提到,未来还需要更多相关的研究去进一步解决对纯合突变的致病基因进行基因编辑修正的问题,这当然也十分具有挑战性。

 

总的来说,实验结果表明这种治疗方法是有效的,且CRISPR-Cas9靶向十分精确,这让人们对该方案的安全性有了更多信心。此外,该实验中并未出现脱靶变异。这些结果表明这种治疗方法或许可以和胚胎植入前遗传诊断一起被用于修正人类胚胎中的遗传性变异。

 

论文第一作者,Hong Ma博士

 

据Shoukhrat Mitalipov实验室官网信息显示,论文第一作者Hong Ma早年是在西安医科大学(现西安交通大学医学部)获得的医学博士学位(MD),后来在日本京都大学获得分子生物学博士学位。Hong Ma博士后来在美国俄亥俄州立大学牙科学院工作了13之久,2008年加入Mitalipov实验室成为一名Staff Scientist负责该实验室的管理。


 

专家点评:

 

黄军就(中山大学生命科学学院)

 

 

 

Comments(原标题《胚胎基因编辑风云再起》):人类基因总数大约在2-2.5万个之间,而已知的单基因变异就能导致的发育异常或疾病有7000多种。遗传疾病的治疗一直困扰着患者家庭和医疗工作者。新型基因编辑技术TALEN和CRISPR/Cas9 技术分别在2012、2013和2015年被 Science 评为十大科学突破之一,是有望彻底终结遗传病的工具。

 

2015年,我们团队在全世界范围内首次尝试利用人的三原核胚胎(临床废弃的不能存活的异常胚胎)研究了CRISPR/Cas9在根治地中海贫血症遗传疾病方面的潜能和风险,发现了在早期三原核胚胎中进行基因编辑还存在脱靶、胚胎镶嵌性和同源重组效率不高等重大瓶颈问题。这些风险也在后续广州医学院第三附属医院范勇团队和刘见桥团队的人胚胎基因编辑研究工作中所证实。

 

在人生殖细胞中的基因编辑工作也引发了全球社会人士和科学家的热点关注,促使了2015年底由美国国家科学院、美国国家医学院、中国科学院和英国皇家学会共同举办的华盛顿人类基因编辑国际峰会的召开,会议明确了体细胞基因编辑研究和临床前早期人类胚胎以及生殖细胞基因编辑基础研究的重要性。随后,2016年2月英国批准在人早期胚胎中进行基因编辑研究;2016年9月,瑞典科学家宣布在正常人类胚胎进行基因编辑研究;2017年2月美国科学院与美国医学院发布了《Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance》,明确地支持临床前早期人类胚胎以及生殖细胞基因编辑基础研究,而临床应用则取决于具体的情况,没有绝对禁止胚胎基因编辑治疗遗传性疾病的可能。英国和瑞典科学家的研究主要是通过基因编辑技术来研究胚胎早期发育重要基因的功能,而今天发表在Nature杂志,由美国科学家Shoukhrat Mitalipov领导,Sanjiv Kaul、Jin-Soo Kim、Paula AmatoJuan carlos izpisua Belmonte作为共同通讯作者的文章“Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos”则是研究如何提高通过CRISPR/Cas9技术在人类早期正常胚胎中治疗遗传性疾病的潜能。

 

文章重点关注常染色体显性遗传病肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)。心肌肌球蛋白结合蛋白-C(MyBP-C)的编码基因MYBPC3,是人类发现的第二个HCM致病基因。该基因突变类型以无义突变和移码突变为主,携带者约占所有HCM患者的30~40%。尽管部分错义突变能够降低MyBP-C与肌球蛋白结合的能力,但多数错义突变既不影响MyBP-C的功能,也不影响其稳定性。

 

总体来说,绝大多数MYBPC3突变属于低危突变。文章利用MYBPC3杂合突变的男性患者的皮肤成纤维细胞制备了诱导多能性干细胞(iPS)以及利用该患者的精子,通过卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)与正常卵子结合获得的正常二倍体胚胎为模型,研究特异靶向突变MYBPC3基因位点的CRISPR/Cas9系统联合ssDNA oligo在人iPS和受精卵疾病模型中修复MYBPC3杂合突变的效率。

 

在iPS细胞模型中,作者发现了10个通过HDR修复的iPS细胞克隆,而这些克隆的基因编辑倾向于采用外源的ssDNA为修复模板进行同源重组修复(HDR)(9/10),只有1个克隆是以WT基因拷贝作为模板修复。而在胚胎中,在修复的42个胚胎中,有1个采用WT基因拷贝作为修复模板。这结果与李劲松研究员和我们组分别在小鼠和人三原核受精卵中的研究结果一致,说明人早期胚胎中的HDR机制与细胞不同

 

作者进一步比较了在人胚胎受精卵时期(原核期)和MII卵子(ICSI注射期)时期注射CRISPR–Cas9所形成胚胎的镶嵌性问题,发现通过将精子与CRISPR/Cas9同时注射到MII期的卵子中,显著降低了基因编辑修复的胚胎中的Mosaic现象。作者认为在早期胚胎中基因组修复更多地采取内源模板利用HDR机制完成,而MII的卵子在ICSI后经历了S和G2的细胞周期,也促进了HDR的发生。这些研究结果的发现正是得益于课题组使用正常的人早期胚胎以及结合了体外试管婴儿的ICSI技术,这也是三原核胚胎研究的不足之处

 

此外,由于论文所用的受精卵全部是杂合子或者野生型的胚胎,大量的研究表明发现,如果仅仅是通过PCR扩增单个卵裂球细胞,等位基因的PCR扩增是有偏好性的,会影响后续深度测序的结果,导致数据可能存在偏差。论文的方法是否在不同的遗传疾病基因,不同的突变位点依然获得高效的修复结果仍然需要更多的研究。在纯合子的遗传突变疾病中,该方法在缺乏内源WT基因模板的时候,能否高效地利用外源DNA模板修复仍需要进一步的探讨。总的来说,论文研究结果对于后期如何开展杂合子遗传疾病有着重要的指导意义。

 

2015 年 3 月,MIT Technology Review 发表了一篇名为“Engineering the Perfect Baby”的文章,Nature Science 杂志皆发表评论性文章,呼吁科学家们暂时不要进行人类胚胎进行基因编辑的研究。2017年7月,MIT Technology Review再次发表的“First Human Embryos Edited in U.S.”的文章,而在今天,Nature杂志刊登了利用正常人类胚胎进行遗传病基因编辑治疗的研究成果。在这巨大的转变过程中,中国科学家与全球科学家一起努力实现了该研究领域的良性发展。美国科学家在NIH禁止将联邦资金用于此类研究资助的情况下,更是走在了国际的前列。回顾生殖发育领域的发展历史,对人类生殖疾病治疗密切相关的前沿研究,如试管婴儿技术研究、人克隆胚胎技术、人兽混合胚胎研究、人兽嵌合体胚胎研究、人“三亲”试管婴儿研究等等,基本都是由欧洲和美国所完成和主导。目前在人类胚胎中利用基因编辑技术研究早期胚胎发育和遗传疾病研究的重要性已经成为了国际共识,相信在今后在国内和国外同行的努力下还会有更多重要的研究成果出现。

 

参考文献:

1、Tachibana, M., Sparman, M., Sritanaudomchai, H., Ma, H., Clepper, L., Woodward, J., ... & Mitalipov, S. (2009). Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature, 461(7262), 367-372.

2、Tachibana, M., Amato, P., Sparman, M., Woodward, J., Sanchis, D. M., Ma, H., ... &  Mitalipov, S.  (2013). Towards germline gene therapy of inherited mitochondrial diseases. Nature, 493(7434), 627-631.

3、Tachibana, M., Amato, P., Sparman, M., Gutierrez, N. M., Tippner-Hedges, R., Ma, H., ... & Mitalipov, S.  (2013). Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell, 153(6), 1228-1238.

4、Liang, P., Xu, Y., Zhang, X., Ding, C., Huang, R., Zhang, Z., ... & Huang, J. (2015). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein & cell, 6(5), 363-372.

5、Kang, X., He, W., Huang, Y., Yu, Q., Chen, Y., Gao, X., ... & Fan, Y. (2016). Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. Journal of assisted reproduction and genetics, 33(5), 581-588.

6、Tang, L., Zeng, Y., Du, H., Gong, M., Peng, J., Zhang, B., ... & Liu, J. (2017). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human zygotes using Cas9 protein. Molecular Genetics and Genomics, 292(3), 525-533.

7、Maron, B. J., McKenna, W. J., Danielson, G. K., Kappenberger, L. J., Kuhn, H. J., Seidman, C. E., ... & Wigle, E. D. (2003). Committee for Practice Guidelines. European Society of Cardiology. American College of Cardiology/European Society of Cardiology clinical expert consensus document on hypertrophic cardiomyopathy. A report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Clinical Expert Consensus Documents and the European Society of Cardiology Committee for Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol, 42(9), 1687-1713.

8、Maron, B. J., & Maron, M. S. (2013). Hypertrophic cardiomyopathy. The Lancet, 381(9862), 242-255.

9、Dhandapany, P. S., Sadayappan, S., Xue, Y., Powell, G. T., Rani, D. S., Nallari, P., ... & Tharkan, J. M. (2009). A common MYBPC3 (cardiac myosin binding protein C) variant associated with cardiomyopathies in South Asia. Nature genetics, 41(2), 187-191.

10、Schlossarek, S., Mearini, G., & Carrier, L. (2011). Cardiac myosin-binding protein C in hypertrophic cardiomyopathy: mechanisms and therapeutic opportunities. Journal of molecular and cellular cardiology, 50(4), 613-620.


 

 

Shoukhrat Mitalipov简介

 

 

Shoukhrat Mitalipov 1961年出生于哈萨克斯坦共和国(Kazakhstan,1991年宣布独立,此前为前苏联的一部分),从1979年开始他作为一名无线电技术员曾在苏联军队服役两年,服役后进入了位于莫斯科的季米利亚捷夫农学院(Timiryazev Agricultural Academy)学习遗传学,1994年在莫斯科医学遗传学研究中心(Research Center for Medical Genetics)获得博士学位,主要从事发育与干细胞相关研究。由于苏联解体后,相关经费缩减,Mitalipov申请到了美国犹他州立大学的Fellowship开始了博士后研究,从1998年起,开始在俄勒冈健康与科学大学(Oregon Health and Science University)国家灵长类动物研究中心(Oregon National Primate Research Center) 工作至今。Mitalipov此前因为置换了一对孪生雄猴的线粒体而名噪一时(2009,Nature),此后在此基础上进一步获得了置换线粒体的人类卵细胞而进一步走进公众视野(2012,Nature),2013年更是因为通过核移植技术首次获得了人类胚胎干细胞而引发学术界和大众的热议(2013,Cell),如今Mitalipov又成为了美国第一位利用基因编辑技术编辑人类胚胎的科学家再次进入各大新闻媒体的头条。

 

另据悉,Shoukhrat Mitalipov博士最近刚刚入选了国家第十三批“千人计划”(短期项目),将在山东大学生殖医学研究中心任职。

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