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特别点评| 3篇Cell Stem Cell 剑指成体肝脏中或无特定标识的“干细胞”群体
2019-12-23

点评 | 何强、李露、张芳、惠利健(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)
撰文 | 珊今
责编 | 兮


希腊传说中普罗米修斯因为人类盗取火种而触犯宙斯,被锁缚后,恶鹰白天啄食他的肝脏, 而其肝脏却在晚上又长出,日复一日承受苦痛。虽是神话,却也道出了肝脏强大的再生能力。实际上早在上世纪30年代就有动物实验表明,切除大鼠肝脏重量的70%后,大鼠仍可以活存,并且余肝可以短时间内再生以达到其原来的重量【1】但是肝脏在再生过程中,同时也包括肝脏在稳态情况下的自我更新过程中的细胞来源问题一直充满争议

人们一般认为肝脏再生过程中细胞可能的来源有三种: 其一, 来自已经存在的成熟肝细胞的分裂增殖;其二,来自干细胞(stem cell)或者前体细胞(progenitor cell)的增殖和分化; 其三,来自于其他细胞的转分化【2】。在正常生理条件下肝脏细胞更新的主要来源这个问题上,人们的认识比较统一,都普遍认为是成熟肝实质细胞的分裂增殖,但是究竟是哪种细胞亚型也不清楚。

2015年,来自于Roel Nusse(1982年发现Wnt基因,HHMI研究员,美国科学院院士)实验室的研究团队在Nature上发表文章Self-renewing diploid Axin2+ cells fuel homeostatic renewal of the liver该文章目前已被引300多次,过去被认为是肝脏领域里程碑式的文章,类比于发现肠道干细胞中的Lgr5+作为标记),通过谱系追踪技术在正常小鼠肝脏中央静脉周围发现一类增殖能力很强的Axin2+二倍体细胞(肝实质细胞多为多倍体细胞),该细胞可持续自我更新,并大量表达具有维持细胞多潜能性作用的转录因子TBX3;此外,该细胞还可从中央静脉向外扩增,且向肝细胞分化,在1年内更换肝脏内约40%的肝细胞,提示着这类细胞可能是稳态情况下肝脏细胞更新的来源细胞【3】。除此之外,还有研究证明, 区域性分布的高表达端粒酶的一类肝实质细胞在正常生理条件和再生过程中都更具有增殖活性【4】

 


然而,2019年12月20日,发表在Cell Stem Cell 上的三篇文章,却反驳了诸多现有的观点,重点针对了上述Nature论文。

第一篇旗帜鲜明地反驳2015年Roel Nusse的工作,该文章来自于诺华制药Jan S. Tchorz课题组,标题为AXIN2+ Pericentral Hepatocytes Have Limited Contributions to Liver Homeostasis and Regeneration

 


在2015年的工作里,作者所采用的鼠为杂合子。为了避免单倍剂量不足效应(haploinsufficiency)对小鼠机体产生的影响,在该篇文章中作者开发了BAC-transgenic Axin2 CreERT2鼠,该鼠有着正常的Wnt信号强度以及正常的Axin2表达。当用他莫昔芬诱导后,Axin2+的细胞会被标记上绿色。出乎作者意料的是,这种变绿在诱导后的七天不再增加,而后的EdU标记实验提示着Axin2+的细胞遗传物质并没有一直复制,而前七天的变绿只是因为他莫昔芬诱导效应的持续;在实验过程中EdU+细胞在肝脏中的各个区域表达是一样的,提示着肝脏细胞的增殖贯穿于整个肝脏,并没有局限于某一区域。
 

左图,谱系追踪Axin2CreERT2EGFP和Axin2CreERTLACZ  右图,EGFP染色统计结果


那在肝脏再生的情况下又是如何呢?研究者们在对小鼠进行肝脏切除手术之前或之后进行他莫昔芬的诱导,发现前者被标记的Axin2明显少于后者,说明在肝脏再生期间,Axin2的上调是原有的肝实质细胞的表达上调,而不是来自于原有的中央静脉周围的Axin2+的细胞。并且根据在此期间的Ki67染色以及EdU标记也说明了在再生期间,所有的肝脏细胞都参与了增殖的过程。为了探究Axin2+的细胞在肝脏的再生以及维持稳态方面的作用,作者用Axin2CreERT2DTA 小鼠模型来将Axin2阳性的细胞杀死,研究人员发现这么做会短时破坏代谢分区,并触发AXIN2/LGR5在所有肝细胞中的上调以及后续中心niche的恢复。

综上这篇工作证明了位于中央静脉周围的Axin2+细胞并没有更优秀的分裂能力,而遍布肝脏的肝细胞不光对维持肝脏稳态有着重要作用,也在肝脏受损伤后的再生过程中上调表达AXIN2/LGR5促进肝脏再生

但是毕竟Axin2或者端粒酶基因都是对机体非常重要的基因,有没有在不改变基因型的情况下观察新生细胞来源的方法呢?接下来的两篇paper就为我们提供了不同的思路。

首先是来自于加州大学旧金山分校的Holger Willenbring所发表的文章Broad Distribution of Hepatocyte Proliferation in Liver Homeostasis and Regeneration。在这篇paper里,作者采用了随机谱系追踪的方法,并不局限于某一表达特定基因的细胞,而是在某一区域标记所有细胞。他们用杂合子小鼠来进行实验,这样的话二倍体和多倍体就可以根据细胞内的荧光基团数来确定。跟第一篇文章的结论一致,他们证实了肝稳态取决于所有区域中肝细胞的适度增殖,而不是某个特定的细胞亚型,而且肝脏再生中的增殖负担分布在每一个肝细胞之间。更有趣的是,这篇文章还揭示了不同倍性的肝细胞在慢性损伤情况下的增殖差异:二倍体肝细胞比多倍体更有效地增殖肝细胞—在正常肝脏中,大多数(69.4%±10.3%)克隆,无论大小或位置如何,都是多倍体,而经过12剂量的CCl4处理后,大多数(71.9%±7.0%)克隆均为二倍体。(这一点和接下来的文章结论不符)

 

Rosa26-Rainbow Cre报告基因和谱系追踪策略


第三篇文章来自于俄勒冈健康与科学大学Markus Grompe团队,标题为In Vivo Lineage Tracing of Polyploid Hepatocytes Reveals Extensive Proliferation during Liver Regeneration。研究人员同样运用谱系追踪的方法确定了多倍体细胞在肝脏再生中发挥的作用。他们发现多倍体肝细胞在肝脏受伤之后能够增殖并与此同时其倍性减少,而倍性减少的后代在接下来的有丝分裂中会增殖并重新多倍体化。
 


总之,三篇工作都无一例外地指出,并没有特定的二倍体/高表达某一基因的肝细胞类群具有更高的分裂能力,肝脏的稳态、受伤后的修复需要众多肝细胞的共同作用,同时三篇文章还各自有其侧重点。真理越辩越明,我们也希望被质疑的相关作者能有进一步的回应(注:BioArt已经联系了2015年Nature论文的第一作者,等待进一步回应),共同推进整个领域向前发展。
 


何强(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所,博士研究生)李露(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所,博士研究生)张芳(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所,博士后)惠利健(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所,研究员)

研究肝脏在稳态维持和损伤修复的细胞来源对于理解肝脏发育,再生和疾病具有重要的意义。现有的单细胞测序数据发现,肝脏细胞具有很强的异质性,从肝门静脉区域(Portal Vein, PV)到肝中央静脉区域(Central Vein, CV)存在不同表达谱的细胞类群(Bahar et al., 2017; Aizarani et al., 2019)。不同类群的细胞对于肝脏的稳态维持和损伤再生的作用一直是肝脏再生领域的核心问题。利用谱系示踪技术标记不同区域的特殊类型细胞,发现肝脏细胞再生可以由不同的肝脏细胞而来。已经报道了一系列对于肝脏稳态维持和损伤修复有重要贡献的细胞类群,包括在肝门静脉区域的Sox9弱阳性hybrid肝细胞(Font-Burgada et al., 2015),Mfsd2a+肝细胞(Pu et al., 2016)和Lgr5+肝细胞(Huch et al., 2013),肝中央静脉区域的Axin2+肝细胞(Wang et al., 2015),以及散在分布于肝小叶的端粒酶高活性Tert+肝细胞(Lin et al., 2018)。有意思的是,肝脏细胞本身还具有较强的细胞可塑性。在损伤条件下,肝门静脉区域的肝细胞会经历重编程的状态成为肝干细胞类似细胞(LPLC),进而完成损伤修复(Yanger et al., 2013;Tarlow et al., 2014b; Li et al., 2019)。此外,肝细胞再生能力受到抑制和肝脏长期严重损伤时,胆管细胞也可以转变为肝细胞,实现损伤修复(Raven et al., 2017; Deng et al., 2018; Russell et al., 2019; Manco, R et al., 2019)。领域内对于不同类群肝细胞在肝脏再生中的作用一直还是存在争议。比如Lgr5+细胞,在最近的工作中,发现Lgr5只能标记中央静脉周围的部分肝细胞,并且在肝脏再生中,相比其他细胞并不具有优势(Planas-Paz et al., 2016;Ang et al., 2019)

在最新一期的cell stem cell上,Markus Grompe团队, Holger Willenbring团队以及Jan Tchorz团队背靠背发表了三篇论文,利用不同的小鼠模型标记肝细胞,进一步探索了不同类型的肝细胞对于组织稳态维持和损伤再生的作用。其中,Tchorz在今年12月初日本Awaji召开的CSH-Asia liver biology and disease会议上报道了这个工作。Willenbring本来也计划在会上报道这个新研究,但临时有急事返美,未能进行报告。

Grompe团队和Willenbring团队随机标记了肝小叶内各个分区的肝细胞,探索其在稳态维持和损伤再生过程中的作用。在Willenbring团队的结果中,他们发现稳态下随机标记的肝细胞都具有缓慢增殖的能力,而在损伤条件下双倍体肝细胞比多倍体细胞具有更强的增殖能力。而Grompe团队则更多关注了肝细胞的多倍性,发现多倍体的肝细胞在移植或者多种慢性损伤过程中能快速减少倍性并且贡献到再生,并且极少出现染色体错误分离(chromosome missegregation),而在再生过程中肝细胞也可以通过有丝分裂恢复多倍性。Tchorz团队的研究进一步检测了Axin2+肝细胞。之前,Nusse团队利用Knock-in方法,报道Axin2+细胞位于中央静脉区域,并认为这些细胞是肝脏干细胞(Wang et al., 2015)。因为Axin2位点Knock-in实际造成了Axin2基因位点的杂合性,这个小鼠模型可能对Wnt响应与野生型小鼠不同。Tchorz采用BAC策略,构建了不影响原位Axin2基因的标记小鼠,利用此小鼠模型,他们发现Axin2+细胞在稳态和损伤再生过程中都不存在肝脏干细胞的特点。相较于其他区域的细胞,Axin2+的细胞在稳态维持和损伤修复过程中的EdU+增殖比例没有优势;而且去除Axin2+肝细胞,也会有周围肝细胞对其进行补充。但是在损伤过程,肝小叶内不同区域的肝细胞都会有Axin2活化,提示Wnt对于肝脏再生还是非常关键。

在这三个工作中,Grompe团队, Willenbring团队以及Tchorz团队都证明了稳态下各区域的肝细胞增殖没有差异,都可以实现自我维持(self-maintain);而在损伤情况下各个区域的肝细胞都会有机会增殖贡献肝脏再生,而不是由特定区域的“肝脏干细胞”贡献。在Grompe团队和Willenbring团队的研究中,通过单细胞随机标记的方法,他们发现在正常情况下肝细胞的增殖很有限,随机标记的单细胞在一年内平均扩增到1.12个细胞的克隆,只有0.9%的细胞能扩增到大于2个细胞的克隆。这与之前散在标记的端粒酶高活性Tert+单细胞6个月可以长到4.13个细胞克隆存在差异,需要进一步研究分析。Tchorz团队利用BAC策略构建的新的Axin2+标记小鼠,结合另外两个工作,提示Nusse团队鉴定的Axin2+肝脏干细胞很可能是不成立的。不过Nusse团队在今年9月份的CSH stem cell biology会议上,报道了采用BAC克隆的Axin2-cre小鼠,仍然发现Axin2+细胞的贡献,具体的技术细节还有待其发表后再了解。这些研究中说明了谱系示踪技术能很好地指示细胞的分化发展,但是不同遗传构建策略可能会影响基因原位表达,导致观察上的偏颇。

至此,对肝脏组织稳态和损伤再生的细胞来源,虽然还有争论,但基本框架已经形成。未来的研究工作,将会集中于探究不同区域细胞在损伤再生过程中的内在响应过程(比如Hippo通路,细胞表观遗传调控等)和外界微环境信号(比如Wnt信号,炎症信号等)如何调控肝脏的损伤再生过程。另外,动物模型的观察结果是否和人类肝脏损伤相关,也需要进一步验证。最后,在长期损伤导致逐步发展成为肝细胞癌的过程中,是否也存在特殊细胞类群的偏好,以及是否可以找到区分再生和癌化的机制,也值得继续探索。

原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.10.011
https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.11.001
https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.11.014


制版人:Leon

参考文献
1. Higgins, G.M.J.A.p., Experimental pathology of the liver; I.Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal.1931. 12: p. 186-202.
2. Stanger,B.Z., Cellular Homeostasis and Repair inthe Mammalian Liver. 2015. 77(1):p. 179-200.
3. Wang,B., et al., Self-renewing diploid Axin2+cells fuel homeostatic renewal of the liver. 2015. 524(7564): p. 180.
4. Lin,S., et al., Distributed hepatocytesexpressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. 2018.556(7700): p. 244.

 

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