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Sci Adv | 基于单细胞超高通量筛选方法的α-1,3-岩藻糖基转移酶分子定向进化
2019-10-15
责编 | 酶美

岩藻糖基化是生物体内一类常见的糖基化修饰,在血型决定、免疫调控、神经发育以及肿瘤发生等生理过程中均发挥着重要作用[1]。含岩藻糖的糖链结构不仅可以作为肿瘤诊断的关键分子标记[2],也有潜力作为抗肿瘤糖疫苗药物[3],或作为益生元广泛地应用于婴儿配方奶粉、功能性食品、食品添加剂以及保健药品等领域[4]。自然界的岩藻糖基化反应由岩藻糖基转移酶(Fucosyltransferases,FucTs催化[5],这类酶的催化活性通常较低,极大的限制了岩藻糖类的大规模应用。

 
酶定向进化技术通过在实验室中模拟自然进化的过程[6],可以有效改善酶的性能。由于其在酶工程领域的重要作用,定向进化技术于2018年获得了诺贝尔化学奖。然而,由于岩藻糖基转移酶的反应难以用常规实验方法进行高通量筛选,对这类酶的定向进化改造一直没有取得突破。

2019年10月9日,上海交通大学生命科学技术学院杨广宇团队(第一作者为博士生谭玉萌张勇助理研究员)Science Advances发表了在岩藻糖基转移酶定向进化方面的最新研究进展“Directed evolution of an α1,3-fucosyltransferaseusing a single-cell ultrahigh-throughput screening method”他们巧妙的利用了细胞膜表面的半乳糖透酶(LacY基因)对底物及糖基化产物通透性的差异,建立了可以利用流式细胞仪在单细胞层面对FucTs进行活性检测的FACS筛选体系,速度达到每小时107个克隆以上,一举打破了这类酶的筛选瓶颈。研究团队证明了这一系统可作为一种通用的筛选工具,用于α-1,3-岩藻糖基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶,以及岩藻糖苷酶的转糖苷活性等糖基化反应的定向进化中。


为验证这一体系的有效性,他们对来源于幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶(FutA)进行了定向进化,成功获得了目前国际报道催化效率最高的突变体,为岩藻糖苷类产品的生物合成提供了高效的催化剂。重要的是,他们通过解析突变酶M32的晶体结构,揭示了突变体功能改变的催化机制,发现突变体α2 Helix的S45突变成F45后,与周围的芳香族氨基酸残基W33和W34形成了独特的“夹钳”结构,将受体底物牢牢的固定在底物结合口袋内,从而使得酶与底物的亲和力提高;并通过分子动力学模拟发现了α5 Helix铰链区D127N,R128E及H131I的三个氨基酸残基的电荷突变促进域间的相对运动变化,提出了动态铰链弯曲运动引发域间运动模型,为揭示GT-B型糖基转移酶的调控机制及进一步的分子改造提供了线索。


该研究建立了首个针对岩藻糖基化酶的单细胞超高通量筛选技术平台,并解析了GT-B型糖基转移酶催化调控的机制,为其它糖基转移酶的分子改造提供了重要的工具和指导,有望促进糖生物技术领域的进步和重要寡糖产品的生物催化产业发展。


论文链接:

https://doi.org/10.1126/sciadv.aaw8451

 

制版人:小娴子 

参考文献

 
[1] Ma B, Simala-Grant JL, Taylor DE.Fucosylation in prokaryotes and eukaryotes. Glycobiology.2006,16(12):158R-184R.
[2] Miyoshi E, Moriwaki K, Nakagawa T.Biological function of fucosylation in cancer biology. JBiochem. 2008,143(6):725-9.
[3] Fuster MM, Esko JD. The sweet and sourof cancer: glycans as novel therapeutic targets. Nat Rev Cancer. 2005,5(7):526-42.
[4] Bode, Lars, et al. "Overcoming thelimited availability of human milk oligosaccharides: challenges andopportunities for research and application."Nutrition Reviews 74.10 (2016): 635-644.
[5]Ma,Bing, Joanne L. Simala-Grant, and Diane E. Taylor. "Fucosylation inprokaryotes and eukaryotes." Glycobiology 16.12 (2006): 158R-184R.
[6]F. H. Arnold, Design by directed evolution. Acc. Chem.Res. 31, 125-131 (1998)


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